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MDS解析セット(OgataScore)


フローサイトメトリー法によるMDSの解析が日本でも注目され始めました

Ogata Scoreはその名のとおりDr.Ogataが開発し2010年頃から欧米を中心に多くの施設で使用されてきたMDSの診断のための解析方法です。みなさん、診断の際にフローサイトメトリー検査をされたと思いますが、それはいわゆる「白血病解析セット」と言われるもので、白血病の診断に使用されるもので、特に芽球の少ないMDSの場合、ほとんど役に立ちません。
MDSの誤診で多いパターンが、良性疾患を低リスクMDSと間違えるというものです。
MDSのFCM解析の意義について、Dr.Ogataの講演から一部を抜粋します。 

(後ほど……)

MDS 解析における FCM の意義

MDS は骨髄細胞に由来する悪性の病気で、頻度の高い疾患です。
骨髄の中では悪性化した造血細胞が増え、血液検査では貧血、血 小板減少、白血球減少(白血球の中でも好中球が減少)などの血球減少を認めます。

診断には、1)血球減少がある、2)骨髄検査で造血細胞に形の異常がある(異形成の確認)、3)血球減少を起こす他の疾患が除外 できる、の 3 つの条件を満たすことが必要です。しかしながら、異形成の確認と他の疾患の除外は、簡単ではないことが多く、しばし ば診断に苦慮します。

WHO 分類では、MDS の診断補助のためフローサイトメトリーを用いた解析が推奨されています。MDS の骨髄細胞から診断に有用な 情報を得るためには、解析法に工夫が必要であり、いくつかの解析プロトコールが提案されています。それらの中でも、Ogata protocol(Ogata score)と呼ばれる解析法は、簡便で再現性が高いため、欧米を中心に多くの施設で使用されています。

参考文献
1. Valent P, Horny HP, Bennett JM, et al. Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the myelodysplastic syndromes: consensus statements and report from a working conference. Leuk Res 31, 727-736, 2007
2. Hasserjian RP, Orazi A, Brunning RD, et al. Myelodysplastic syndromes: overview. In WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th Edition. 2017. Edited by Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al.
3. Ogata K, Della Porta MG, Malcovati L, et al. Diagnostic utility of flow cytometry in low-risk myelodysplastic syndromes: a prospective validation study. Haematologica 94, 1066-1074, 2009
4. Porwit A, van de Loosdrecht AA, Bettelheim P, et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of myelodysplastic syndromes-proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS. Leukemia. 28, 1793-1798, 2014

Ogata protocol(Ogata score)の概要

MDS と良性疾患との鑑別を目的にしたフローサイトメトリー(FCM)解析法です。
骨髄細胞を CD34, CD45, CD19(又は CD10)の 3 種類の抗体で染色し、以下の 4 つの定量的なパラメーターを測定します。




Ogata protocol(Ogata score)の解析方法

① 3 × 105 個の細胞を CD34, CD45, CD19 で染色し、フローサイトメーターで十分な数の有核細胞の情報を保存します(有核細胞数 10 万個以上を目標にします)。
② 図 1 : 細胞を SSC とFSC のプロット上に展開します。溶血した赤血球断片や血小板などを除外し、全有核細胞(P1)をゲートします。 図 2 : 同じプロット上で、未熟細胞が存在する場所(単核球エリア, P2)をゲートします。

③ 図 3 : P2 の細胞を CD45 とCD34 で展開し、CD34 陽性細胞をゲーティングします(P3)。
④ 図 4 : P3 の細胞の中で CD19 陽性のものをゲーティングします(P4)。P4 の細胞には色を付けておきます。

 

⑤ P3 細胞を CD34 とSSC で展開します。P4 細胞は左下方に集団をつくります。
⑥ P4 細胞が形成した集団(P6, CD34 陽性未熟 B 細胞)とそれ以外(P5, CD34 陽性骨髄系未熟細胞)を別々にゲーティングします。

 

⑦P1 細胞を CD45 とSSC で展開し、顆粒球(P8)とリンパ球(P7)をゲーティングします。

⑦ 図 8 : 顆粒球(P8)とリンパ球(P7)の SSC の最頻値(mode 値)を求めます。 図 9 : CD34 陽性骨髄系未熟細胞(P5)とリンパ球(P7)の CD45 発現量の平均値(GeoMean)を求めます。


以上で得た情報から、4 つのパラメーター値を算出します。

CD34 陽性未熟 B 細胞の少ない検体について
MDS 検体中の CD34 陽性未熟 B 細胞は、著減したり欠落していることがしばししばです。以下に MDS 検体の CD34 陽性未熟 B 細胞 の解析例を示します。解析の参考にして下さい


参考文献
1. Ogata K, Della Porta MG, Malcovati L, Picone C, Yokose N, Matsuda A, Yamashita T, Tamura H, Tsukada J, Dan K. Diagnostic utility of flow cytometry in low-risk myelodysplastic syndromes: a prospective validation study. Haematologica 94, 1066-1074, 2009
2. Della Porta MG, Picone C, Pascutto C, Malcovati L, Tamura H, Handa H, Czader M, Freeman S, Vyas P, Porwit A, Saft L, Westers TM, Alhan C, Cali C, Van de Loosdrecht AA, Ogata K. Multicentre validation of a reproducible flow cytometric score for the diagnosis of low-risk myelodysplastic syndromes: results of a European LeukemiaNET study. Haematologica 97, 1209-1217, 2012

結果の客観性
Ogata score で用いるパラメーターはいずれも定量的であるため、測定結果は客観的に判断できます.。

各パラメーターの意味
1)CD34 陽性骨髄系未熟細胞(%)
このパラメーターは、顕微鏡検査での骨髄芽球比率に類似するものです。CD34 陽性の骨髄系未熟細胞数が 1000 個、全有核細 胞数が 10 万個の場合は、1000 ÷ 10 万 = 0.01 で 1% となります。良性疾患でこれが 2%を超えることはまれであり、3%を超え るとほぼ骨髄系腫瘍と言えます。骨髄系腫瘍には、MDS の他に骨髄性白血病などがあり、MDS とこれらとの鑑別は芽球比率や 核型検査などで行います。

2)CD34 陽性未熟 B 細胞(%) CD34 陽性未熟 B 細胞は、顕微鏡検査では骨髄芽球と鑑別が難しい細胞ですが、FCM では容易に同定できます。CD34 陽性未熟 B 細胞数が 100 個、全 CD34 陽性細胞数が 1000 個の場合は、100 ÷ 1000 = 0.1 で 10%となります。MDS ではしばしば CD34 陽性未熟 B 細胞が減少し、5%以下となります。

3)顆粒球の SSC MDS の特徴である好中球系細胞の脱顆粒を、FCM で定量します。顆粒球の SSC の分布から、FCM が最も頻度の高い SSC 値(SSC の最頻値[mode 値])を読み取ります。FCM のデータは機器の種類や設定によって変化しますので、同じ検体中のリンパ球 SSC の最頻値も読み取ります。顆粒球 SSC の最頻値とリンパ球 SSC の最頻値との比を求めることで、機器の種類や設定による誤差を 最小限に抑えます。

4)CD34 陽性骨髄系未熟細胞の CD45 発現量 CD34 陽性骨髄系未熟細胞の CD45 発現量(平均蛍光強度)を FCM で定量します。同じ検体でリンパ球の CD45 発現量も求め ます。CD34 陽性骨髄系未熟細胞の CD45 発現量とリンパ球の CD45 発現量の比を求めることで、機器の種類や設定による誤差 を最小限に抑えます。MDS の CD34 陽性骨髄系未熟細胞は、しばしば CD45 抗原の発現異常(増強あるいは逆に低下)を示し ます。

結果の判定
それぞれのパラメーターの基準値を各施設で求めておく必要があります。基準値は血球減少を示す良性疾患や正常骨髄を用いて決定 します。以下に、多施設国際研究で用いられた基準値を示します。あなたの施設で求めた基準値が、以下の値から大きく外れている 場合は、測定系に不備があるかもしれません



4つのパラメーター中2つ以上が異常値を示す場合、MDSなどの骨髄系腫瘍の可能性が非常に高いと考えられます。1つのパラメーター のみが異常の場合については、CD34 陽性骨髄芽球(%)、あるいは顆粒球の SSC が基準値を大きく逸脱している場合は、やはり MDS などの可能性が高いと考えられています。MDS であっても、これら 4 つのパラメーターに異常がない場合もありますので、この 点には留意して下さい。

参考文献
1. Della Porta MG, Picone C, Pascutto C, Malcovati L, Tamura H, Handa H, Czader M, Freeman S, Vyas P, Porwit A, Saft L, Westers TM, Alhan C, Cali C, Van de Loosdrecht AA, Ogata K. Multicentre validation of a reproducible flow cytometric score for the diagnosis of low-risk myelodysplastic syndromes: results of a European LeukemiaNET study. Haematologica 97, 1209-1217, 2012
2. Ogata K, Sei K, Saft L, Kawahara N, Porta MGD, Chapuis N, Yamamoto Y. Revising flow cytometric mini-panel for diagnosing low-grade myelodysplastic syndromes: Introducing a parameter quantifying CD33 expression on CD34+ cells. Leukemia Research 71, 75-81, 2018
        

 
Ogata Protocolの共同研究者であるヨーロピアン・リューケミア・ネット(ELN)の面々と
2013年ドイツのミュンヘンにて



  

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